對乳制品中進(jìn)行內(nèi)酰胺酶檢測的方法分享
更新時間:2022-06-21 文章更新于2022-06-21 點擊次數(shù):981次
乳中抗生素的來源主要有兩種途徑,一是采用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療牛乳腺炎造成牛乳中抗生素殘留,二是奶牛長期喂飼含抗生素的飼料,很容易造成乳中抗生素殘留川。飲用含有抗生素的牛奶可能導(dǎo)致飲用者對抗生素的過敏反應(yīng),或因長期接觸抗生素而導(dǎo)致耐藥。泌乳奶牛經(jīng)過藥品合理間隔期后擠奶,可以減少抗生素在奶中殘留,實現(xiàn)無抗奶。因此,世界各國都嚴(yán)格限定原料乳抗生素最大殘留*'2。β-內(nèi)酰胺酶是由對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥菌株分泌的一種胞外酶。該酶可選擇性分解β-內(nèi)酰胺類抗生素,能夠使青霉素內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)破壞而失去活性。由于利益驅(qū)動使得不法分子利用β-內(nèi)酰胺酶降解乳中所含抗生素。該酶的使用掩蓋了牛奶中實際含有的抗生素,導(dǎo)致青霉素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高,從而大大降低了人們抵抗傳染病的能力。
對乳制品中進(jìn)行內(nèi)酰胺酶檢測的方法:
1.范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物的檢驗方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)的檢驗。
本方法的檢出限為4U/mL。
2.原理
該方法采用對青霉素類藥物絕對敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株,利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性,并加入青霉素作為對照,通過比對加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與未加入抑制劑的樣品所產(chǎn)生的抑制圈的大小來間接測定樣品是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。
3.操作步驟
3.1 菌懸液的制備
將藤黃微球菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上,經(jīng)36士1℃培養(yǎng)18h-24 h,用生理鹽水洗下菌苔即為菌懸液,測定菌懸液濃度,終濃度應(yīng)大于1×1010 CFU/mL,4 ℃保存,貯存期限2周。
3.2 樣品的制備
將待檢樣品充分混勻,取1 mL待檢樣品于1.5 mL離心管中共4管,分別標(biāo)為:A、B、C、D,每個樣品做三個平行,共12 管,同時每次檢驗應(yīng)取純水1 mL加入到1.5 mL離心管中作為對照。如樣品為乳粉,則將乳粉按1:10的比例稀釋。如樣品為酸性乳制品,應(yīng)調(diào)節(jié)pH值至6-7。
3.3 檢驗用平板的制備
取90mm滅菌玻璃培養(yǎng)皿,底層加10 mL滅菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后上層加入5 mL含有濃度為1×108 CFU/mL藤黃微球菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后備用。
3.4 樣品的測定
按照下列順序分別將青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到樣品及純水中:
A 青霉素5 μL。
B 舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。
C β-內(nèi)酰胺酶25 μL、青霉素G5 μL。
D β-內(nèi)酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。
混勻后,將上述A~D 試樣各200 μL 加入放置于檢驗用平板上的4個無菌牛津杯中,36士1℃培養(yǎng)培養(yǎng)18~22 h ,測量抑菌圈直徑。每個樣品,取三次平行試驗平均值。
3.5 結(jié)果報告
純水樣品結(jié)果應(yīng)為:(A)、(B)、(D)均應(yīng)產(chǎn)生抑菌圈;(A)的抑菌圈與(B)的抑菌圈相比,差異在3 mm以內(nèi)(含3 mm),且重復(fù)性良好;(C)的抑菌圈小于(D)的抑菌圈,差異在3 mm以上(含3 mm),且重復(fù)性良好。如為此結(jié)果,則系統(tǒng)成立,可對樣品結(jié)果進(jìn)行如下判定:
6.1 如果樣品結(jié)果中(B)和、(D)均產(chǎn)生抑菌圈,且(C)與(D)抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm)時,可按7.1.1、7.1.2 判定結(jié)果。
6.1.1(A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm),且重復(fù)性良好,應(yīng)判定該試樣添加有β- 內(nèi)酰胺酶,報告β- 內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗結(jié)果陽性。
6.1.2(A)的抑菌圈同(B)的抑菌圈差異小于3 mm,且重復(fù)性良好,應(yīng)判定該試樣未添加有β- 內(nèi)酰胺酶,報告β- 內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗結(jié)果陰性。
6.2 如果(A)和(B)均不產(chǎn)生抑菌圈,應(yīng)將樣品稀釋后再進(jìn)行檢測。
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